Desde su invención hace casi 400 años, los microscopios que utilizan lentes de vidrio y luz se han vuelto irremplazables en los laboratorios de todo el mundo. Existen instrumentos más potentes, como los microscopios electrónicos, pero cuestan millones y requieren una formación y un mantenimiento costosos, lo que los hace poco realistas para la mayoría de los laboratorios.
Por ello, los laboratorios dependen principalmente de microscopios confocales, que utilizan luz y lentes para ampliar los objetos. Pero la imagen pierde foco cuando el tamaño del objeto que se está viendo se acerca al tamaño de la longitud de onda de la luz utilizada para observarlo. A estas escalas, el objeto desvía la luz mediante un fenómeno llamado difracción.
Los microorganismos, como bacterias, hongos y virus, existen en este rango de tamaño y la difracción se convierte en un problema para los microbiólogos y patólogos que intentan buscarlos y diagnosticarlos.
En los últimos ocho años, una técnica llamada microscopía de expansión ha superado las limitaciones de la microscopía óptica, mejorando la resolución de los microscopios tradicionales al expandir los microbios que se observan, como su nombre indica.
Ahora, un grupo de investigadores de biotecnología dirigidos por Yongxin Zhao de la Universidad Carnegie Mellon está superando aún más sus límites.
Expansión de microbios
El microscopio de expansión expande la muestra utilizando lo que se llama… Hidrogel de polielectrolito. Estos geles son redes de moléculas repetidas que son súper absorbentes y se hinchan cuando se agrega agua. Las biomoléculas específicas, como las proteínas de la muestra, están ancladas a la matriz del gel. A medida que el gel se hincha, las muestras se expanden cuatro veces de manera similar, eliminando la difracción.
El desafío de la microscopía de expansión es garantizar la expansión uniforme de la muestra, lo que se ve obstaculizado por la presencia de una pared celular en muchos microbios: todas las bacterias y los hongos tienen esta capa exterior resistente que evita la expansión. Además, cada una de las biomoléculas inmovilizadas en gel requiere un paso de inmovilización específico, lo que hace que el proceso requiera más mano de obra y limita los tipos de muestras que se pueden expandir.
En junio de 2023, Yongzhen Zhao Publicada una nueva plataforma de microscopio de expansión Consiste en un hidrogel que une universalmente varias biomoléculas a través de una matriz de gel. Esto proporciona una expansión más uniforme de las muestras y aumenta los tipos de organismos y tejidos que se pueden observar. Sin embargo, persistían dos problemas: la pared celular y su capacidad para etiquetar e identificar estructuras específicas.
La salsa secreta para expandir la pared celular
Para resolver el primer problema, muchos han intentado utilizar enzimas para descomponer o alterar la pared celular, pero el éxito de este tratamiento por sí solo ha sido limitado. Según Zhao, su alumno Changyu Zheng, autor principal del libro. Nuevo papel en ciencia avanzada Al describir las últimas mejoras en su protocolo de microscopía no invasiva llamado μMagnify, encontraron las condiciones ideales para derribar las paredes de una amplia gama de organismos.
«La salsa secreta es una combinación de tratamiento térmico más una combinación de enzimas que digieren la pared celular», explicó Chow. Con esta receta, pueden ampliar ocho veces la variedad de patógenos y tejidos infectados, incluidas biopelículas bacterianas y fúngicas resistentes y problemáticas.
Durante una infección activa, muchas bacterias y hongos se agrupan y producen una capa protectora muy densa llamada biopelícula. Estas defensas son difíciles de penetrar y son una de las causas de las infecciones resistentes a los medicamentos.
El protocolo μMagnify ha mejorado la resolución de las biopelículas bajo el microscopio, lo que brinda una ventaja significativa a los investigadores que estudian algunas de las infecciones más difíciles en humanos.
Nombrar proteínas
Un segundo desafío al que se enfrentan los microbiólogos y patólogos es identificar estructuras o proteínas clave en las células que están observando. Esto les permite identificar microorganismos específicos en función de sus proteínas únicas o mostrar cómo el patógeno interactúa con las células huésped y causa enfermedades.
Por ejemplo, algunas bacterias E. coli producen una toxina que destruye las células intestinales y las etiquetas fluorescentes permiten a los investigadores ver este tipo de moléculas y determinar cómo y dónde funcionan.
Para hacer esto, las etiquetas fluorescentes están diseñadas para apuntar a biomoléculas específicas y emitir luz de color una vez que se unen. La clasificación de las muestras suele limitarse a cuatro colores porque las longitudes de onda de la luz coloreada comienzan a superponerse, lo que significa que los colores se mezclan y son indistinguibles para el ojo humano.
«Sin embargo, en nuestro caso, después de obtener imágenes de estos cuatro colores, puedes quitar esas etiquetas y reemplazarlas con otras cuatro etiquetas», dijo Zhao.
Esta capacidad de enjuague y repetición permite múltiples rondas de etiquetado en una sola muestra. Combinando esto con una mayor ampliación de la imagen, los investigadores pueden visualizar múltiples interacciones y estructuras de proteínas en 3D en un solo organismo o sección de tejido.
Rentable y simple
El sistema μMagnify aumentó inmediatamente la potencia y la versatilidad de cualquier microscopio confocal que ya se encuentre en el laboratorio. Según Zhao, el coste es de unos 10 dólares por muestra y el protocolo es tan sencillo que “cualquier laboratorio del mundo puede hacerlo”.
Para los laboratorios ubicados en lugares con menos recursos pero con muchos patógenos microbianos, como el África subsahariana o el sudeste asiático, este sistema parece increíblemente útil.
Zhao y su equipo incluso desarrollaron un programa de realidad virtual inmersivo llamado ExMicroVR para visualizar los datos y permitir que varios investigadores vean y trabajen en la misma muestra simultáneamente.
Referencia: Yong-Xin Zhao, et al. MicroMagnify: un método de microscopía multiplexante para examinar patógenos y tejidos infectadosCiencia avanzada (2023), DOI: 10.1002/advs.202302249
Desde su invención hace casi 400 años, los microscopios que utilizan lentes de vidrio y luz se han vuelto irremplazables en los laboratorios de todo el mundo. Existen instrumentos más potentes, como los microscopios electrónicos, pero cuestan millones y requieren una formación y un mantenimiento costosos, lo que los hace poco realistas para la mayoría de los laboratorios.
Por ello, los laboratorios dependen principalmente de microscopios confocales, que utilizan luz y lentes para ampliar los objetos. Pero la imagen pierde foco cuando el tamaño del objeto que se está viendo se acerca al tamaño de la longitud de onda de la luz utilizada para observarlo. A estas escalas, el objeto desvía la luz mediante un fenómeno llamado difracción.
Los microorganismos, como bacterias, hongos y virus, existen en este rango de tamaño y la difracción se convierte en un problema para los microbiólogos y patólogos que intentan buscarlos y diagnosticarlos.
En los últimos ocho años, una técnica llamada microscopía de expansión ha superado las limitaciones de la microscopía óptica, mejorando la resolución de los microscopios tradicionales al expandir los microbios que se observan, como su nombre indica.
Ahora, un grupo de investigadores de biotecnología dirigidos por Yongxin Zhao de la Universidad Carnegie Mellon está superando aún más sus límites.
Expansión de microbios
El microscopio de expansión expande la muestra utilizando lo que se llama… Hidrogel de polielectrolito. Estos geles son redes de moléculas repetidas que son súper absorbentes y se hinchan cuando se agrega agua. Las biomoléculas específicas, como las proteínas de la muestra, están ancladas a la matriz del gel. A medida que el gel se hincha, las muestras se expanden cuatro veces de manera similar, eliminando la difracción.
El desafío de la microscopía de expansión es garantizar la expansión uniforme de la muestra, lo que se ve obstaculizado por la presencia de una pared celular en muchos microbios: todas las bacterias y los hongos tienen esta capa exterior resistente que evita la expansión. Además, cada una de las biomoléculas inmovilizadas en gel requiere un paso de inmovilización específico, lo que hace que el proceso requiera más mano de obra y limita los tipos de muestras que se pueden expandir.
En junio de 2023, Yongzhen Zhao Publicada una nueva plataforma de microscopio de expansión Consiste en un hidrogel que une universalmente varias biomoléculas a través de una matriz de gel. Esto proporciona una expansión más uniforme de las muestras y aumenta los tipos de organismos y tejidos que se pueden observar. Sin embargo, persistían dos problemas: la pared celular y su capacidad para etiquetar e identificar estructuras específicas.
La salsa secreta para expandir la pared celular
Para resolver el primer problema, muchos han intentado utilizar enzimas para descomponer o alterar la pared celular, pero el éxito de este tratamiento por sí solo ha sido limitado. Según Zhao, su alumno Changyu Zheng, autor principal del libro. Nuevo papel en ciencia avanzada Al describir las últimas mejoras en su protocolo de microscopía no invasiva llamado μMagnify, encontraron las condiciones ideales para derribar las paredes de una amplia gama de organismos.
«La salsa secreta es una combinación de tratamiento térmico más una combinación de enzimas que digieren la pared celular», explicó Chow. Con esta receta, pueden ampliar ocho veces la variedad de patógenos y tejidos infectados, incluidas biopelículas bacterianas y fúngicas resistentes y problemáticas.
Durante una infección activa, muchas bacterias y hongos se agrupan y producen una capa protectora muy densa llamada biopelícula. Estas defensas son difíciles de penetrar y son una de las causas de las infecciones resistentes a los medicamentos.
El protocolo μMagnify ha mejorado la resolución de las biopelículas bajo el microscopio, lo que brinda una ventaja significativa a los investigadores que estudian algunas de las infecciones más difíciles en humanos.
Nombrar proteínas
Un segundo desafío al que se enfrentan los microbiólogos y patólogos es identificar estructuras o proteínas clave en las células que están observando. Esto les permite identificar microorganismos específicos en función de sus proteínas únicas o mostrar cómo el patógeno interactúa con las células huésped y causa enfermedades.
Por ejemplo, algunas bacterias E. coli producen una toxina que destruye las células intestinales y las etiquetas fluorescentes permiten a los investigadores ver este tipo de moléculas y determinar cómo y dónde funcionan.
Para hacer esto, las etiquetas fluorescentes están diseñadas para apuntar a biomoléculas específicas y emitir luz de color una vez que se unen. La clasificación de las muestras suele limitarse a cuatro colores porque las longitudes de onda de la luz coloreada comienzan a superponerse, lo que significa que los colores se mezclan y son indistinguibles para el ojo humano.
«Sin embargo, en nuestro caso, después de obtener imágenes de estos cuatro colores, puedes quitar esas etiquetas y reemplazarlas con otras cuatro etiquetas», dijo Zhao.
Esta capacidad de enjuague y repetición permite múltiples rondas de etiquetado en una sola muestra. Combinando esto con una mayor ampliación de la imagen, los investigadores pueden visualizar múltiples interacciones y estructuras de proteínas en 3D en un solo organismo o sección de tejido.
Rentable y simple
El sistema μMagnify aumentó inmediatamente la potencia y la versatilidad de cualquier microscopio confocal que ya se encuentre en el laboratorio. Según Zhao, el coste es de unos 10 dólares estadounidenses por muestra y el protocolo es tan sencillo que “cualquier laboratorio del mundo puede hacerlo”.
Para los laboratorios ubicados en lugares con menos recursos pero con muchos patógenos microbianos, como el África subsahariana o el sudeste asiático, este sistema parece increíblemente útil.
Zhao y su equipo incluso desarrollaron un programa de realidad virtual inmersivo llamado ExMicroVR para visualizar los datos y permitir que varios investigadores vean y trabajen en la misma muestra simultáneamente.
Referencia: Yongxin Zhao, et al. MicroMagnify: un método de microscopía multiplexante para examinar patógenos y tejidos infectadosCiencia avanzada (2023), DOI: 10.1002/advs.202302249
Crédito de imagen destacada: Logan Moreno Gutiérrez en Unsplash
