En un estudio reciente publicado en bioRxiv* Servidor de preimpresión, los investigadores de Weill Cornell Medical College evaluaron la escisión de la escisión de la proteína espiga (S) de las variantes preocupantes (COV) del SARS-CoV-2 y los coronavirus relacionados por varias proteasas del huésped.
La proteasa huésped SARS-CoV-2 (y otros coronavirus) escinde la S en los límites de las subunidades S 1 y 2 (S1/S2), exponiendo así los péptidos a la fusión del SARS-CoV-2 y las membranas de las células huésped que facilitan el SARS-CoV -2 entrada en el anfitrión. En un estudio anterior, los autores demostraron que las proteasas del huésped, como los factores de coagulación, escinden el SARS-CoV-2 S y mejoran la invasión del huésped por parte del SARS-CoV-2.
estancia: Evolución de las interacciones de la proteasa del huésped entre las variantes preocupantes del SARS-CoV-2 y los coronavirus relacionados. Crédito de imagen NIAID
sobre estudiar
En este estudio, los investigadores amplían su análisis anterior al evaluar la escisión S1/S2 del SARS-CoV-2 y otros coronavirus por proteasas del huésped como la furina, la proteasa de membrana serina 2 (TMPRSS2), la trombina y el factor de coagulación Xa. Utilizaron ensayos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) para explorar el efecto de los mutantes de COV del SARS-CoV-2 en la escisión de la proteína S correspondiente por parte de las proteasas del huésped. Además, también se evaluó la escisión de las proteínas S de otros coronavirus por proteasas.
Se examinaron submuestras de bases de datos como Nextstrain y Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID) para detectar la diferencia de secuencia del codón 681 de S entre los COV del SARS-CoV-2. En particular, el equipo investigó el efecto de las mutaciones en las variantes del SARS-CoV-2 en la escisión de S1/S2 por parte de las proteasas del huésped comparando la cinética de la enzima. [maximum initial velocity (Vmax)] sobre sustratos con los mutantes P681 y P681H correspondientes a la cepa Wuhan-Hu-1 (progenitor) y Alpha VOC, respectivamente.
Además, se evaluó la actividad de nafamostat en la inhibición de las proteasas involucradas en la entrada del SARS-CoV-2. El efecto de la fosforilación en la escisión S1/S2 mediada por proteasa en los residuos de serina (Ser) ubicados cerca del sitio de escisión S1/S2 se determinó usando sustratos de fosforilación idénticos a los residuos S689, S680 y S686.
Además, se evaluó el efecto de las modificaciones postraduccionales sobre la escisión de S1/S2. Finalmente, la escisión S1/S2 mediada por proteasa ha evolucionado a través de otros coronavirus relacionados como el SARS-CoV, el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV), el virus del resfriado común (HCoV-OC43) y el virus de la bronquitis infecciosa (IBV)- Beaudette , y coronavirus de murciélago (RatG13).
consecuencias
El codón S 681, ubicado en el sitio de escisión S1/S2, fue uno de los sitios de mayor entropía en el genoma del SARS-CoV-2 en las muestras. Las mutaciones P681H y P681R identifican VOC alfa y delta, respectivamente. Si bien la mutación p681H mejoró la actividad del factor Xa, no hubo cambios en la actividad de escisión de furina, trombina y TMPRSS2.
Sin embargo, la mutación P681R mejoró los valores de Vmax del factor de coagulación Xa mediado por la escisión S1/S2 del SARS-CoV-2 y la escisión S1/S2 mediada por furina en un 65 % y un 99 %, respectivamente, en comparación con el Wuhan. -cepa Hu-1. Por el contrario, la trombina y TMPRSS2 mostraron una actividad reducida del sustrato que expresa p681R.
La secuencia de SARS-CoV-2 spike-681 divergió entre las variantes de preocupación. (a) Diagrama esquemático de la proteína del pico SARS-CoV-2, destacando la posición 681 adyacente al sitio S1/S2. tasa de (Kastenhuber et al., 2022). Un subconjunto de 3043 muestras del período comprendido entre diciembre de 2109 y mayo de 2022 se obtuvo de GISAID y se visualizó utilizando Nextstrain (https://nexttrain.org/ncov) (Elba y Buckland-Merrett, 2017; Hadfield et al., 2018). (B) Frecuencia de genomas virales secuenciados con prolina (negro), histidina (rojo) o arginina (azul) en el codón de pico 681 por fecha de recolección de la muestra. (C) Árbol filogenético proporcionado por Nextstrain. El genotipo en S681 de cada muestra se indica como prolina (gris), histidina (rojo) o arginina (azul). Las ramas correspondientes a las variables dominantes de interés se destacan en el anillo exterior.
Navamostat inhibió los factores de coagulación, TMPRSS2 y otras proteínas de serina transmembrana involucradas en la entrada del SARS-CoV-2. Mientras que el Factor Xa mostró una Vmax más alta para los sustratos variantes que expresan P681Rv y P681H y los mutantes, el Factor Xa mostró una sensibilidad equivalente a nafamostat para la escisión de los sustratos P681Rv y P681H. Fosforilación de Ser 680 en la posición P6 por encima del sitio de escisión S1/S2, escisión mediada por furina completamente terminada y escisión S1/S moderadamente afectada (30% a 50% de inhibición) por factor Xa, trombina y TMPRSS2.
La fosforilación de Ser 686 en la posición P1 ubicada cerca del sitio de escisión S1/S2 inhibe fuertemente la actividad de todas las proteasas probadas. Por el contrario, la fosforilación de Ser 689 en la posición C-terminal de P4 afectó la escisión de S1/S2, de modo que TMPRSS2 y el Factor Xa se inhibieron moderadamente mientras que la trombina se inhibió fuertemente y, por el contrario, se observó un aumento de la escisión mediada por furina.
Las modificaciones postraduccionales por fosforilación afectaron significativamente la susceptibilidad a la escisión S1/S2. La susceptibilidad a las proteasas fue diferente para todos los coronavirus probados y solo el sitio de escisión del SARS-CoV-2 mostró escisión por las cuatro proteasas probadas. El factor Xa mostró una notable capacidad de escisión de los sitios de escisión S1/S2 de SARS-CoV-2 y HCoV-OC.
Huella proteolítica de varias cepas de coronavirus(a) Relación filogenética de un grupo de coronavirus con los sitios de escisión S1/S2 y S2 compatibles correspondientes. Mapas de calor que representan la velocidad inicial V0 de escisión de los sustratos peptídicos indicados (filas) y concentraciones (columnas) por (B) factor Xa. (C) Verín (Dr) TMPRSS2 y (mi) trombina;
Furin mostró eficacia contra la cepa HCoV-OC43 S1/S2-OC43/Seattle, pero no contra la cepa S1/S2-OC43/ATCC de HCoV-OC43. Además, el furano cortó eficientemente el límite S1/S2 y el sitio de escisión S2 de la cepa IBV-Beaudette. La trombina mostró escisión en las proteínas S de MERS, SARS y SARS-CoV-2, pero no escindió significativamente RatG13.
TMPRSS2 escindió las proteínas S (en los sitios de escisión S1/S2 y S2) de varios coronavirus, aunque la eficacia de escisión fue relativamente baja. Además, el equipo observó la afinidad de los coronavirus relacionados de forma lejana para lograr interacciones de proteasa coanfitrión, incluidos los factores de coagulación. Esto indica que el uso de proteasas del huésped puede haber sido una presión selectiva a través de la evolución de los coronavirus.
En general, los resultados del estudio mostraron que, si bien los COV del SARS-CoV-2 mostraron interacciones divergentes entre los sitios de escisión S1/S2 y la proteasa del huésped, se observó una evolución convergente de la escisión del huésped mediada por proteasa entre diferentes coronavirus.
*Nota IMPORTANTE
bioRxiv Publica informes científicos preliminares que no han sido revisados por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, orientar la práctica clínica o el comportamiento relacionado con la salud ni tratarse como información establecida.
