El estudio de la dinámica de las interacciones ARN-proteína en células vivas.

Como lo menciona el genetista Theodosius Dubzansky1 En 1973, “Nada en biología tiene sentido excepto a la luz de la evolución”. Muchos biólogos modernos agregarían que nada tiene sentido en biología molecular excepto a la luz de la bioquímica: sin la comprensión cuantitativa que proporciona la bioquímica, ¿cómo pueden los biólogos predecir el efecto de una doble reducción en los niveles de proteínas durante el desarrollo temprano de un organismo, o un aumento? de diez veces la concentración de otra proteína en las células cancerosas? El abismo entre los experimentos simplistas de la bioquímica y la complejidad caótica de la célula siempre ha parecido insuperable. Ahora mismo, Escritura naturalezaSharma Et al.2 Informe una técnica que permite el análisis bioquímico de reacciones moleculares en las células.

Los autores se centraron en la dinámica de las interacciones entre moléculas de ARN y proteínas. Las moléculas de ARN mensajero se unen a diferentes proteínas unidas al ARN (RBP), que controlan casi todos los aspectos del ciclo de vida del ARNm, desde el procesamiento inicial de los ARN recién hechos hasta su destrucción final.3. Cada RBP puede unirse a cientos de moléculas de ARN, por lo que cada RNA puede unirse a docenas de diferentes RBP.4. Además, las interacciones entre proteínas y ARN no son estables.5Y el6. Alternativamente, las proteínas pueden unirse rápidamente y separarse de los ARN diana con la misma rapidez (Figura 1), y estas dinámicas son el núcleo de la regulación genética. En otras palabras, la cinética de las interacciones de las proteínas de ARN es la fuerza impulsora de la expresión génica. Por lo tanto, definir los parámetros de esta motilidad en las células es fundamental para comprender completamente la regulación de la expresión génica.

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Figura 1 | Un método para sondear las interacciones de ARN y proteínas en las células. Las proteínas que actúan sobre las moléculas de ARN se unen rápidamente y se separan de sus sitios de unión diana. Se necesitan mediciones de las tasas de unión y disociación para una comprensión cuantitativa de la regulación genética, pero fue imposible realizarlas en células vivas. Sharma Et al.2 Descripción de un método llamado KIN-CLIP que utiliza pulsos ultrarrápidos de luz ultravioleta para generar enlaces covalentes entre proteínas unidas y moléculas de ARN en las células. Esto no solo permite la identificación de objetivos de ARN de proteína (como fue posible en las técnicas de enlace sináptico informadas anteriormente), sino que, debido a la velocidad del proceso de entrecruzamiento, también permite la determinación de la cinética de enlace y disociación.

Aunque las interacciones del ARN de la proteína con la proteína se han investigado durante décadas, no se han determinado las características de su movimiento en las células. En general, el conocimiento cinético solo estaba disponible en en el laboratorio Estudios con proteínas puras. Los experimentos en células han podido identificar objetivos de ARN para las RBP, pero carecen de la precisión para medir la cinética de las reacciones.5. Con la llegada de los métodos de secuenciación de alto rendimiento, en el laboratorio Los enfoques ahora pueden investigar la cinética de las interacciones de proteínas con decenas de miles de variantes de ARN.7. Sin embargo, estos experimentos todavía se están realizando con proteínas puras en ausencia de un entorno celular. En los últimos años, ha existido un método llamado reticulación e inmunofluorescencia.8 (CLIP) se ha convertido en la columna vertebral para caracterizar las interacciones de ARN y proteínas en las células. En CLIP, la proteína sintetizada se une covalentemente a una molécula de ARN con ARN usando luz ultravioleta. Luego, los complejos se aíslan y el ARN reticulado se determina mediante secuenciación de alto rendimiento. Este enfoque proporciona un índice de ARN que se unen a un RBP específico en el entorno complejo de la célula, pero proporciona, en el mejor de los casos, solo una instantánea de estas interacciones.

Sharma y sus colegas ahora están reduciendo la brecha entre en el laboratorio Estrategias y CLIP mediante el desarrollo de un tipo de CLIP que puede determinar los parámetros cinéticos de las interacciones de las proteínas de ARN en las células. La idea principal de los autores era que algunos aspectos técnicos de los métodos CLIP informados anteriormente impedían que estos métodos fueran útiles para capturar parámetros cinemáticos. El desafío más desafiante es que las velocidades de reticulación deben ser rápidas para capturar las velocidades a las que las proteínas y las moléculas de ARN se unen y degradan. Las fuentes UV convencionales no pueden lograr una reticulación lo suficientemente rápido, por lo que usarlas para medir la cinética es como usar una velocidad de obturación lenta para fotografiar un caballo corriendo: todo se difumina en una imagen. Este descubrimiento llevó a los autores a utilizar un láser ultravioleta de femtosegundos pulsado, que une las proteínas al ARN con la suficiente rapidez para capturar los parámetros cinéticos. Llaman a su método KIN-CLIP (para CLIP cinemático).

Para probar el método, los investigadores lo aplicaron a un RBP llamado Dazl, que es necesario para la producción de células reproductivas y regula la expresión génica.9. Dazl se une a cientos de ARNm diana, aumentando su estabilidad y la cantidad de proteínas producidas.10. Sin embargo, a pesar de su importancia biológica, se desconoce mucho sobre la unión y función de Dazl, lo que lo convierte en un candidato ideal para los ensayos de KIN-CLIP.

Sharma et al., Validaron por primera vez que KIN-CLIP identifica objetivos de ARN presentes en conjuntos de datos publicados anteriormente producidos a partir de la “instantánea” de CLIP. Luego calcularon los parámetros cinéticos, conocidos como constantes de velocidad, para la unión y disociación de Dazl con cada uno de los miles de sitios de unión en el ARN. Estos resultados mostraron que la unión de Dazl es muy dinámica: su tiempo de unión es corto; RBP reside en sitios únicos durante solo unos segundos. Dazl rara vez se une, por lo que los sitios de unión están libres de proteínas la mayor parte del tiempo.

Los autores también encontraron que múltiples moléculas de Dazl tienden a unirse en sitios muy cercanos. El análisis cinético sugiere que esto puede deberse a la unión cooperativa, un fenómeno en el que la unión de una proteína a un sitio aumenta la probabilidad de que otras proteínas se unan a sitios proximales. Finalmente, los autores incorporaron los parámetros cinéticos recientemente definidos de Dazl en un modelo predictivo de su efecto en la expresión génica, proporcionando así una base bioquímica para su función y allanando el camino para futuras investigaciones.

Uno de los aspectos más interesantes de este estudio es el potencial de KIN-CLIP para estudiar otras prácticas comerciales restrictivas, pero el método tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, como ocurre con todas las tecnologías basadas en CLIP, la capacidad de unir una proteína de interés a los ARN es un requisito; Esto puede resultar difícil, porque algunas proteínas no contienen las cadenas laterales necesarias orientadas adecuadamente para la reticulación. Sin embargo, el mayor obstáculo para las posibles transformaciones de KIN-CLIP es que se necesita un equipo de reticulación especializado: el acceso a un femto-láser pulsado puede no ser fácil para muchos biólogos. Además, los procedimientos experimentales y el análisis asociados con las bibliotecas KIN-CLIP son más complejos que los de los experimentos CLIP estándar y pueden llegar a ser otra barrera para la adopción.

Sin embargo, este estudio incorporó herramientas bioquímicas a las células vivas y, al hacerlo, puede proporcionar un punto de inflexión en el estudio de las interacciones entre ARN y proteínas. El siguiente paso es aplicar KIN-CLIP a otras RBP, pero la posibilidad de aplicarlo a otros tipos de biomoléculas también se ilumina en el horizonte. De hecho, los autores han notado de manera interesante que un láser de femtosegundos pulsado puede unir proteínas al ADN, tal vez “ADN KIN-CLIP” a mano. Sharma y sus colegas no solo establecieron un nuevo estándar en biología del ARN, sino que también pudieron haber desatado el poder de la bioquímica en la biología molecular en general.

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